В связи с последними событиями у всех на слуху слово «импортозамещение». Его применяют к месту и не к месту, под него выделяют огромное финансирование. Но мало кто помнит тех, кто ещё 10 лет назад были первопроходцами в деле реального создания конкурентоспособных технологий. Одним из таких центров является Опытное биотехнологическое производство ИБХ РАН, где в 2003 году начали выпуск генно-инженерного инсулина человека по первой в России технологии полного цикла, за что работавшие над этим сотрудники в 2006 году были удостоены премии Правительства РФ в области науки и техники. И с тех пор в ОБП был разработан целый ряд технологий производства биологических препаратов. Каких и в чём вообще заключается разработка - читайте в этой статье.

Обычно выделяют четыре «цветных» направления биотехнологии: «красная», «синяя», «белая» и «зелёная». «Белая» - промышленная - является одной из самых старых отраслей. Она занимается крупнотоннажным производством различных химических соединений, применяемых в быту: витаминов, спирта и т.д. «Синяя» - морская - занимается приложением биотехнологии к проблемам рационального использования ресурсов океанов. К весьма перспективным направлениям относят «зелёную» отрасль - растительную, в которой генетически модифицируют деревья и сельхозкультуры, а также разрабатывают методы переработки растительного сырья и отходов в полезную для промышленности продукцию. В этом она близка «белой» и по сути является её развитием на более высоком уровне. Но больше всего развито «красное» направление, в котором создаётся продукция для медицинского применения, в основном - биофармацевтические препараты.

Страницы истории

Начало становлению медицинской биотехнологии было положено давно, ещё в начале 70-х годов прошлого века с изобретения технологии рекомбинантной ДНК . А уже в 1982 году был зарегистрирован первый препарат, полученный таким способом - инсулин. В Советском Союзе понимали перспективы этого нового направления, и по настоянию академика Ю.А. Овчинникова, директора , в открытом в 1984 году новом здании института целых два корпуса было выделено под комплексную опытную установку. Основной её задачей являлась разработка технологий получения фармпрепаратов, в особенности биотехнологической природы. Оснащение для тех лет было вполне на мировом уровне, однако перестройка и развал Советского Союза наложили негативный отпечаток - в 90-е годы опытная установка стала не нужна, и большинство специалистов ушло.

Технология рекомбинантной ДНК

Осенью на «биомолекуле» мы опубликовали статью студентки Пермского государственного национального исследовательского университета « » . И хотя речь в ней не о разработке препарата для крупной промышленности, статья даёт представление обо всех этапах получения патента на определённый штамм микроорганизма, созданный биотехнологическим путём. - Ред.

Для задач непосредственно производства создаётся специальный рабочий банк из сотен ампул, каждая из которых предназначена для получения отдельной партии препарата. Этот банк также закладывается на хранение в музей культур (рис. 2).

Далее проводится разработка основной биотехнологической стадии - культивирования клеток. В её ходе выбирают оптимальный состав среды, на которой выращивают клетки, режим культивирования (непрерывный или периодический), его аппаратурное оформление и параметры (pH, температура, скорость подачи и состав подпитки). Основная цель, преследуемая на этом этапе, - повышение объёмной продуктивности, что позволяет получать на оборудовании небольшого масштаба большое количество продукта, достаточное для решения испытательной задачи. Кроме того, за счёт этого снижается и себестоимость получения продукта - в десятки, а то и сотни раз от первоначального лабораторного способа. Решением всех этих задач занимается цех экспериментальной ферментации опытного производства (рис. 3).

Рисунок 3. Контроль за ходом процесса в пилотном ферментёре рабочим объёмом 20 л в цехе экспериментальной ферментации.

В конце культивирования получается культуральная жидкость, содержащая помимо отработанной среды и биомассы клеток ещё и продукт, который необходимо выделить. В зависимости от выбранного вида клеток, продукт может либо выделяться в среду, либо синтезироваться внутри клеток, иногда в виде телец включения (агрегатов из белков). А если смотреть шире, то в случае клеточной или тканевой терапии продуктом будут сами клетки. При выделении сначала отделяют клетки (биомассу) от отработанной среды. Если продукт содержится в среде, то в работу идёт она, а клетки направляют на дезактивацию (в отходы).

Если же продукт получается в тельцах включения, то дезактивируют среду, а клетки разрушают, выделяют тельца и растворяют (солюбилизируют) их. Полученный раствор помимо продукта содержит ещё и белки, выделяемые клетками в среду или синтезирующиеся в виде телец включения, так что для достижения «фармацевтической» степени чистоты требуется несколько ступеней очистки. Чаще всего это несколько (от двух) различных типов хроматографических процессов: ионообменного, гидрофобного, обращённо-фазового, гель-фильтрационного (рис. 4). Для каждого продукта их последовательность и количество будут разные и требуют подбора на основе литературных данных, опыта и экспериментов. Кроме того, для каждого процесса нужно выбирать буферные растворы и стратегию их подачи на хроматографическую колонну. Конечная цель - это продукт высочайшей степени чистоты: иногда более 99,9%, а это означает, что все возможные примеси могут составлять не более 0,1% от массы активной фармацевтической субстанции - результата этой стадии. Очисткой и разработкой её стратегии в рамках опытного биотехнологического производства занимается цех выделения и очистки .

Рисунок 4. Производственное оборудование. Слева: Препаративный хроматограф и буферные растворы, применяемые для крупномасштабной очистки биопрепаратов. Справа: Кристаллизация инсулина в цехе выделения и очистки.

Однако для проведения доклинических и клинических исследований субстанции недостаточно, необходимо ещё изготовить готовую лекарственную форму (ГЛФ) - добавить вспомогательные вещества и упаковать во флаконы или картриджи для шприц-ручек. И если способ упаковки в основном зависит от аппаратного оформления конкретного производства, то вспомогательные вещества в большей степени зависят от препарата и для каждого подбираются отдельно. Хотя здесь не требуется сложных статистических методов и большого количества экспериментов, процесс получения ГЛФ довольно трудоёмкий, и им также занимается отдельное подразделение - цех готовых лекарственных форм (рис. 5).

Немного о терминах

Когда говорят о фармпрепаратах, часто произносят два термина: активная фармацевтическая субстанция (АФС) и готовая лекарственная форма (ГЛФ). АФС или просто субстанция - по сути, главное действующее вещество, которое и отвечает за основной эффект препарата. ГЛФ или готовая форма - это АФС вместе со вспомогательными веществами и в определённом виде: таблетки, капсулы, раствора во флаконе или картридже.

Рисунок 5. Работа в «чистой» зоне. Слева: Разлив готовой формы биопрепарата в цехе готовых лекарственных форм. Справа: Контроль процесса разлива в цехе готовых лекарственных форм. Эффектный комбинезон совсем не для того, чтобы смотреться круто. Конечную форму производят в стерильных условиях в крайне чистой среде. Чтобы в окружающую среду не попадало лишних частиц, все части тела изолируются, а вся косметика перед входом в чистую зону смывается. Работать в таких условиях весьма непросто - несколько часов, и ты уже готов одним махом опустошить полуторалитровую бутылку воды. Не говоря уже о том, что всё это время ты будешь мечтать о дýше.

Казалось бы, дойдя уже до готовой формы, можно переходить непосредственно к доклиническим исследованиям, ведь именно это чаще всего является целью производства лекарственных веществ на мощностях ОБП. Однако прежде необходимо проанализировать полученный продукт, чтобы убедиться в соответствии его характеристик ожидаемым и заложить конкретные параметры в регистрационное досье, которое необходимо для регистрации препарата в регуляторных органах. На данном этапе важно показать, что количество примесей не превышает разрешённого, а полученное основное действующее вещество имеет структуру и активность, соответствующие ожидаемым. Спектр применяемых здесь методов довольно широк: вестерн-блот , изоэлектрофокусировка , хроматография, ЛАЛ-тест , масс-спектрометрия, имунноферментный анализ , ИК-спектроскопия и многие другие. Выбор конкретных методов зависит в первую очередь от природы биопрепарата и для каждого из них во многом индивидуален. Хотя есть и стандартные общие методы вроде электрофореза в полиакриламидном геле или изоэлектрофокусировки. В большинстве же методов, пусть они и являются стандартными в части общей последовательности действий, параметры проведения нуждаются в отдельной проработке для каждой готовой формы, так как вспомогательные вещества иногда влияют на аналитические характеристики основного.

Описанный этап является крайне важным, так как даёт оценку качественным характеристикам препарата и их постоянству от партии к партии. Технология - это не только получение какого-то конкретного продукта и достижение высокой эффективности процесса. Это ещё и умение стабильно обеспечивать высокое качество продукта. Помимо контроля конечного продукта осуществляют промежуточный контроль критических точек производственного процесса, чтобы как можно раньше выявить отклонения, способные повлиять на качество конечного препарата, и минимизировать время и затраты на их устранение. На опытном биотехнологическом производстве за этот этап отвечает отдел контроля качества при участии контрольно-аналитической лаборатории (рис. 6).

Рисунок 6. Важен контроль! Слева: Контрольно-аналитическая лаборатория - все в сборе. Справа: Микробиологический контроль образцов с производства в отделе контроля качества.

Разведка боем

Занимаясь биотехнологией, ты вынужден постоянно знакомиться с новыми передовыми научными достижениями в разных областях: молекулярной биологии, синтетической биологии, химическом приборостроении, IT и многих других. При правильном сочетании полученных знаний и рождается эффективная технология. Это трудный, кропотливый, но очень увлекательный процесс.

Но самые сильные, ни с чем, пожалуй, несравнимые чувства испытываешь, когда, используя инструментарий, созданный природой в ходе эволюции и модифицированный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, удается получить конкретный лекарственный препарат, который, возможно, кому-то облегчит состояние, а кого-то и спасет. Это просто круто!

Сотрудник группы эукариотических продуцентов Даниил Павленко раскрывает этот вопрос несколько иначе:

Меня всегда привлекало ориентированное на практику творчество. Создание чего-то, что не просто работает, но ещё и делает это эффективно, т.е. с затратой минимума ресурсов, дарит массу положительных эмоций. Биотех хорош тем, что здесь простор для творчества просто огромен: можно заниматься разработкой сред для выращивания культур, можно основательно вложиться в разработку классного вектора, можно подбирать оптимальные настройки аппаратного обеспечения, можно менять метаболизм клеток-продуцентов, а уж какой простор открывается, если заняться созданием уникальных аппаратов и технологических линий!.. Впечатляют и возможные результаты: комбинация всех подходов может привести к понижению себестоимости производства на порядок, а то и два. Так, мы в своей технологии получения фолликул-стимулирующего гормона определенным изменением достигли увеличения продуктивности, а, следовательно, и уменьшения себестоимости, в 3,5 раза. И понимаем, куда надо двигаться, чтобы повысить продуктивность ещё раз в 5–10. Не удивительно, что от этого всего захватывает дух.

За науку

В прикладных исследованиях научные публикации - дело пусть и не десятое, но явно отходящее на второй план. Основными результатами деятельности являются патенты, ноу-хау, регламенты на конкретные препараты. Статьи же по прикладным исследованиям обычно публикуются в специализированных журналах с соответствующей тематикой, импакт-фактор у которых обычно не переваливает за 3. С фундаментальными исследованиями здесь конкурировать не выйдет, но это не значит, что на опытном производстве науки нет совсем. Например, коллективом ОБП были обнаружены такие явления как антимикробное действие шиконина или эффект вытеснения при очистке генно-инженерного инсулина человека. Хотя большинство статей посвящено разработке отдельных производственных стадий, методов анализа или целых технологий .

Не только работа

Несмотря на серьёзность задач и практическую ориентированность, сотрудники ОБП - живые люди и не прочь поболтать «за жизнь». Собираются обычно пятничными вечерами в кабинете начальника производства Василия Степаненко, который, понимая, что задуманное на остаток дня ему завершить уже не дадут, также включается в беседу. Хотя и тут всё начинается с обсуждения текущих дел и задач и, перетекая в обсуждение стратегии и состояния дел в России и мире, в итоге выходит на разговор о философских и мировоззренческих вопросах.

Обучение без отрыва от производства

Несмотря на высокий уровень ответственности, на ОБП есть успешный опыт выполнения работ студентами и аспирантами с защитой ими магистерских и кандидатских диссертаций. В основном на базе ОБП выполнялись работы вроде создания схем отдельных этапов в производстве какого-либо препарата, подбора условий проведения процессов с целью увеличения выхода, разработки и валидации аналитических методик. Но помимо задач, связанных непосредственно с разработкой технологий создания биологических препаратов, позиционирование производства как опытного подразумевает и возможность отработки различных технических решений. Так, сейчас начато сотрудничество с Университетом машиностроения по направлению разработки различных приборов и аппаратов, применяемых в биотехнологическом производстве.

При этом идей, куда можно двигаться, и каким будет будущее «красной» биотехнологии, предостаточно. Если смотреть глобально, то есть несколько возможных направлений:

В каком направлении всё двинется? Пока сказать сложно, но во многом это будет зависеть от молодёжи, полной прорывных идей и мотивации к созиданию нового.

Литература

1. Полякова М. (2010). Несахарное производство . Сайт ИБХ ;
2. Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал ;
3. Прикладная биотехнология и молекулярная микробиология. Практическое руководство для студентов, или как запатентовать биопрепарат ;
4. Karyagina T.B., Arzumanyan V.G., Timchenko T.V., Bairamashvili D.I. (2001). Antimicrobial activity of shikonin preparations . Pharm. Chem. J. 35 , 435–436;
5. Gusarov D., Nekipelova V., Gusarova V., Lasman V., Bairamashvili D. (2009). Displacement effect during HPLC preparative purification of human insulin . J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 , 1216–1220;
6. Gusarov D.A., Sokolova I.V., Gusarova V.D., Evteeva E.A., Vorob’eva T.V., Kosarev S.A. (2012). Development of effective pilot-scale technology for producing N,N-bis-met-histone H1.3 used for lymphoma treatment . Pharm. Chem. J. 46 , 234–240;
7. Urmantseva V.V., Gaevskaya O.A., Karyagina T.B., Bairamashvili D.I. (2005). The effect of amino acids as components of nutrient medium on the accumulation of protoberberine alkaloids in the cell culture of Thalictrum minus . Russ. J. Plant Physiol. 52 , 388–391;
8. Gusarova V., Vorobjeva T., Gusarov D., Lasman V., Bayramashvili D. (2007). Size-exclusion chromatography based on silica-diol for the analysis of the proinsulin fusion protein . J. Chromatogr. A. 1176 , 157–162;
9. Zhang Y.H. (2010). Production of biocommodities and bioelectricity by cell-free synthetic enzymatic pathway biotransformations: challenges and opportunities . Biotechnol. Bioeng. 105 , 663–677;

Крупно- и маломасштабное производство

Необходимо отметить, что в зависимости от цели производства и конечного продукта различают крупно- и маломасштабное производство. Их основные различия заключаются в следующем:

Объем используемых установок и реакторов – маломасштабное производство 100-1000 л, крупномасштабное- 10 000 л.;

Стоимость продукции – маломасштабного производства- высокая, крупномасштабного- невысокая;

Тип продукции – маломасштабного производства- высокоспециализированный для медицины, фармацевтики и.т.п., крупномасштабного - малоспециализированные предметы потребления;

Основные приемы получения – маломасштабного- гентические манипуляции, крупномасштабного технология ферментации, инженерия процессов; стоимость НИР – маломасштабное высокая, крупномасштабное умеренная.

Мы уже поняли, что в основе всех биотехнологических процессов лежит использование способности живых организмов трансформировать дешевый субстрат в более дорогие и ценные продукты или эненргию. Чистую культуру микроорганизма одного вида, происходящую из одной колниеобразующей единицы с характерным геномом и стабильными свойствами называют штаммом.

Производственные штаммы представляют большую ценность в виду того, что их селекция требовала значительных затрат, а кроме того с их помощью получают значительные объемы коммерческого продукта.

Существуют целые коллекции культур микроорганизмов. Например, одна из самых больших коллекций – АТСС – американская коллекция культур микроорганизмов. Существует с начала 20 века. В Республике Беларусь есть коллекции полезных микроорганизмов в Институте микробиологии НАН Беларуси, в мясо-молочном институте НАНБ. Коллекции патогенных микроорганизиов есть при Институте микробиологии и эпидемиологии МЗ РБ и в Институте экспериментальной ветеринарии им.С.Н.Вышелесского.

Производственные штаммы микроорганизмов должны обладать способностью к росту на дешевых питательных средах, высокой скоростью роста и образованию целевого продукта, стабильностью производственных свойств, безвредностью штамма и целевого продукта для человека и окружающей среды.

Микроорганизмы, используемые в промышленности, проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды.

Основные принципы промышленной организации биотехнологических процессов

Получение засевной дозы

В технологическом процессе используются полезные свойства штамма, следовательно, необходимо сохранять и, если возможно, улучшать его производственные качества. Поэтому в биотехнологическом производстве имеется отделение чистой культуры, задачей которого является постоянное и надежное воспроизведение полезных свойств продуцента. Такое отделение проводит контроль и сохранение чистой культуры, а также маломасштабное культивирование для постоянной передачи штамма на стадию ферментации. Фактически это микробиологическая лаборатория, с музеем штаммов-продуцентов. В ходе контрольных высевов и маломасштабных ферментаций (в пробирках, колбах и т. д.) контролируется устойчивость всех имевшихся или приобретенных признаков, послуживших основанием для рекомендации к промышленному применению этих культур. По мере необходимости из отделения чистой культуры получается масса инокулята, идущая в производство.

При периодическом процессе культивирования (при производстве метаболитов) в отделении чистой культуры готовят засевную дозу клеток для каждой из операций основного производства. При непрерывном производстве кормового белка этого не требуется, однако для повышения качества продукта предпочитают время от времени вводить клетки штамма-продуцента из отделения чистой культуры.

Посевные дозы выращиваются последовательно в колбах и бутылях на 10-20 литров, находящихся на качалках или просто в термостатируемом помещении, и далее в последовательности ферментеров объемом (по необходимости) 10, 100, 500 и 1000 литров, в которых осуществляется перемешивание, аэрация и термостатирование культуральной жидкости с клетками.

Отделение чистой культуры должно иметь достаточно большую коллекцию штаммов продуцентов, так как возможны временные переходы с одного штамма на другой, вызванные различными причинами. Например, сезонные изменения температуры частично компенсируются подбором достаточно продуктивных термотолерантных штаммов. Кроме того, микробиологическая промышленность зачастую вынуждена использовать в качестве компонентов питательных сред отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности (меласса, кукурузный экстракт), что ведет к сезонным изменениям сырья и предполагает адаптацию продуцента к особенностям среды. Все это делает роль микробиологической службы производства достаточно высокой.

При производстве вакцин и биологических препаратов используют систему посевных серий. В начале создают первичную посевную серию штамма с известными свойствами. Для получения каждой производственной серии рассевают 1 единицу хранения первичной посевной серии. Это важное требование закреплено в правилах ВОЗ для обеспечения стабильности свойств вакцин и диагностических препаратов.

Если вернуться к основным этапам биотехнологического процесса и рассмотреть их с точки зрения принятых методов, то можно отметить, что на стадии сырья и его подготовки используют общепринятые методы.

Чаще всего – сырье это питательная среда для продуцентов. Поэтому, часто проводят его подготовку путем стерилизации, используя автоклавирование или гамма-облучение.

Методы на стадии ферментации и биотрансформации более разнообразны.

1) селекция продуктов;

3) технология рекомбинантных ДНК

4) реакторное культивирование

На стадии конечной обработки и получения целевого продукта используются, в основном, методы фракционирования

1) центрифугирование;

2) фильтрация;

3) дезинтеграция;

4) ультрафильтрация;

5) сушка: сублимационная и в падающем потоке.

Использование грибов, плесеней, дрожжей, актиномицетов

Их используют для получения:

→ антибиотиков (пенициллы, цефалоспорины);

→ каротиноидов (астаксантин, придающий мякоти лососевых рыб красно-оранжевый оттенок, его вырабатывают Rhaffia rhodozima, которых добавляют в корм на рыбозаводах);

→ белка (Candida, Saccharomyces lipolitica);

→ сыров типа рокфор и камамбер (пенициллы);

→ соевого соуса (Aspergillus oryzae).

Из 500 известных видов дрожжей первыми стали использовать Saccharomyces cerevisiae, этот вид используется и наиболее интенсивно.

Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae – это непатогенные одноклеточные микроорганизмы с диметром клетки примерно 5 мкм, которые во многих отношениях представляют собой эукариотический аналог E . coli . Их генетика, молекулярная биология и метаболизм детально изучены. S . cerevisiae размножаются почкованием и хорошо растут на такой же простой среде, как и E . coli . Их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления алкогольных напитков и хлеба. В настоящее время ежегодно во всем мире расходуется более 1 млн. тонн S . cerevisiae . Дрожжи S . cerevisiae представляют также большой научный интерес. В частности, они являются наиболее удобной моделью для исследования других эукариот, в том числе человека, поскольку многие гены, ответственные за регуляцию клеточного деления S . cerevisiae , сходны с таковыми у человека. Это открытие способствовало идентификации и – характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразований. Широко используемая генетическая система дрожжей (искусственная хромосома) является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека. В 1996 г. была определена полная нуклеотидная последовательность всего набора хромосом S . cerevisiae , что еще более повысило ценность этого микроорганизма для научных исследований. Такая работа на эукариотах была выполнена впервые.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто приходится повергать ферментативной модификации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соединения во многих случаях это необходимо для правильного функционирования белка. К сожалению, E . coli и другие прокариоты не способны осуществлять эти модификации, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S . cerevisiae , а также другие виды дрожжей: Kluyveromyces lactis , Saccharomyces diastaticus , Schizisaccharomyces pombe , Yarrowia lipolytica , Hansenula polymoгрha . Наиболее эффективными продуцентами полноценных рекомбинантных белков являются P . pastoris и H . polymoгрha .

Дрожжи Kluyveromyces fragilis сбраживают лактозу. Их используют для получения спирта из сыворотки молока.

Saccharomycopsis lipolytica деградирует углеводороды и употребляется для получения белковой массы. Все три вида принадлежат к классу аскомицетов.

Другие полезные виды относятся к классу дейтеромицетов (несовершенных грибов), так как они размножаются не половым путем, а почкованием. Candida utilis растет в сульфитных сточных водах (отходы бумажной промышленности). Trichosporon cutaneum, окисляющий многочисленные органические соединения, включая некоторые токсичные (например, фенол), играет важную роль в системах аэробной переработки стоков.

Промышленные дрожжи обычно не размножаются половым путем, не образуют спор и полиплоидны. Последним объясняется их сила и способность адаптироваться к изменениям среды культивирования (в норме ядро клетки S.cerevisiae содержит 17 или 34 хромосомы, т.е. клетки либо гаплоидны, либо диплоидны).

Плесени вызывают многочисленные превращения в твердых средах. Пищевые продукты на основе сброженных плесневыми грибами Rhizopus oligosporus соевых бобов или пшеницы содержат в 5-7 раз больше рибофлавина и никотиновой кислоты, чем исходный субстрат. Плесени также продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и т.д.), органические кислоты и антибиотики. Их применяют и в производстве сыров, например, камамбера и рокфора.

Искусственное выращивание макромицетов или грибов способно внести важный вклад в обеспечения продовольствием населения земного шара.

Наиболее легко поддаются искусственному выращиванию древоразрушающие грибы.

Простейшие в биотехнологии

Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. До недавнего времени они использовались лишь как компонент активного ила при биологической очистке сточных вод. В настоящее время они привлекли внимание исследователей как продуценты биологически активных веществ.

В этом качестве рациональнее использовать свободноживущих простейших, обладающих разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе.

Особую экологическую нишу занимают простейшие, обитающие в рубце жвачных животных. Они обладают ферментом целлюлазой, способствующей разложению клетчатки в желудке жвачных. Простейшие рубца могут быть источником этого ценного фермента

Возбудитель южноамериканского трипаносомоза - Trypanosoma (Schizotrypanum cruzi) стала первым продуцентом противоопухолевого препарата круцина (СССР) и его аналога-трипанозы (Франция). Изучая механизм действия этих препаратов, советские ученые (Г. И. Роскин, Н. Г. Клюева и их сотрудники), а также их французские коллеги (Ж. Кудер, Ж. Мишель-Брэн и др.) пришли к выводу, что эти препараты оказывают цитотоксический эффект при прямом контакте с опухолью и ингибируют ее опосредованно, путем стимуляции ретикулоэндотелиальной системы. Выяснилось, что ингибирующее действие связано с жирнокислотными фракциями.

Водоросли

Водоросли используются, в основном, для получения белка. Весьма перспективны в этом отношении и культуры одноклеточных водорослей, в частности высокопродуктивных штаммов рода Chlorella и Scenedesmus. Их биомасса после соответствующей обработки используется в качестве добавки в рационы скота, а также в пищевых целях.

Одноклеточные водоросли выращивают в условиях мягкого теплого климата (Средняя Азия, Крым) в открытых бассейнах со специальной питательной средой. К примеру, за теплый период года (6-8 месяцев) можно получить 50-60 т биомассы хлореллы с 1 га, тогда как одна из самых высокопродуктивных трав - люцерна дает с той же площади только 15- 20 т урожая.

Хлорелла содержит около 50 % белка, а люцерна - лишь 18 %. В целом в пересчете на 1 га хлорелла образует 20-30 т чистого белка, а люцерна - 2-3,5 т. Кроме того, хлорелла содержит 40 % углеводов, 7-10 % жиров, витамины А (в 20 раз больше), B2, К, РР и многие микроэлементы. Варьируя состав питательной среды, можно процессы биосинтеза в клетках хлореллы сдвинуть в сторону накопления либо белков, либо углеводов, а также активировать образование тех или иных витаминов.

При завоевании племен майя миссионерами описывался случай, когда испанцы около полутора лет осаждали крепость на вершине горы. Естественно, что все продукты давно должны были кончиться, однако крепость не сдавалась. Когда же она была наконец взята, то испанцы с удивлением увидели в ней небольшие пруды, где культивировались одноклеточные водоросли, из которых индейцы готовили особый сыр. Испанцы попробовали его и нашли весьма приятным на вкус. Однако это было уже после того, как испанцы уничтожили абсолютно всех защитников и секрет племени был утерян. В наше время делались попытки определить этот вид водорослей, из которых готовился сыр, но они не увенчались успехом.

В пищу употребляют около 100 видов макрофитных водорослей

В целом ряде стран водоросли используют как весьма полезную витаминную добавку к кормам для сельскохозяйственных животных.

Наряду с кормами водоросли давно применяют в сельском хозяйстве в качестве удобрений. Биомасса обогащает почву фосфором, калием, йодом и значительным количеством микроэлементов, пополняет также ее бактериальную, в том числе азотфиксирующую, микрофлору. При этом в почве водоросли разлагаются быстрее, чем навозные удобрения, и не засоряют ее семенами сорняков, личинками вредных насекомых, спорами фитопатогенных грибов.

Одним из самых ценных продуктов, получаемых из красных водорослей, является агар - полисахарид, присутствующий в их оболочках и состоящий из агарозы и агаропектина. Количество его доходит до 30-40 % от веса водорослей (водоросли лауренция и грацилярия, гелидиум). Водоросли - единственный источник получения агара, агароидов, каррагинина, альгинатов. В мире ежегодно получается более 16 тыс. т агара.

Бурые водоросли являются единственным источником получения одних из самых ценных веществ водорослей - солей альгиновой кислоты, альгинатов. Альгиновая кислота - линейный гетерополисахарид, построенный из связанных остатков (3 - Д-маннуроновой и α - L-гиулуроновой кислот.

Альгинаты исключительно широко применяются в народном хозяйстве. Это изготовление высококачественных смазок для трущихся деталей машин, медицинские и парфюмерные мази и кремы, синтетические волокна и пластики, стойкие к любой погоде лакокрасочные покрытия, не выцветающие со временем ткани, производство шелка, клеящих веществ исключительно сильного действия, строительных материалов, пищевые продукты отличного качества - фруктовые соки, консервы, мороженое, стабилизаторы растворов, брикетирование топлива, литейное производство и многое другое. Альгинат натрия - наиболее используемое соединение - способен поглощать до 300 весовых единиц воды, образуя при этом вязкие растворы.

Бурые водоросли богаты также весьма полезным соединением - шестиатомным спиртом маннитом, который с успехом применяют в пищевой промышленности, фармацевтике, при производстве бумаги, красок, взрывчатки и др.

Растения в биотехнологии

Водный папоротник азолла ценится как органическое азотное удобрение, так как растет в тесном симбиозе с сине-зеленой водорослью анабена. Азолла быстро размножается простым делением: часть листьев отделяется от материнского растения и начинает самостоятельную жизнь. При благоприятных условиях способна удваивать свою биомассу каждые трое суток.

Представители семейства рясковых (Lemnaceae) - самые мелкие и простые по строению цветковые растения, величина которых редко превышает 1 см. Цветут крайне редко. Рясковые - свободноживущие водные плавающие растения.

Рясковые ( Lemna minor, L. trisulca, Wolfia, Spirodela polyrhiza ) служат кормом для животных, для уток и других водоплавающих птиц, рыб, ондатры.



Биотехнология молочных продуктов

Спектр продуктов питания, получаемых при помощи микроорганизмов, обширен. Это продукты, получаемые в результате брожения - хлеб, сыр, вино, пиво, творог и так далее. До недавнего времени биотехнология использовалась в пищевой промышленности с целью усовершенствования освоенных процессов и более умелого использования микроорганизмов, но будущее здесь принадлежит генетическим исследованиям по созданию более продуктивных штаммов для конкретных нужд, внедрению новых методов в технологии брожения.

Получение молочных продуктов в пищевой промышленности построено на процессах ферментации. Основой биотехнологии молочных продуктов является молоко. Молоко (секрет молочных желез) - уникальная естественная питательная среда. Она содержит 82-88% воды и 12-18% сухого остатка. В состав сухого молочного остатка входят белки (3,0-3,2%), жиры (3,3-6,0%), углеводы (молочный сахар лактоза - 4,7%), соли (0,9-1%), минорные компоненты (0,01%): ферменты, иммуноглобулины, лизоцим и т.д. Молочные жиры очень разнообразны по своему составу. Основные белки молока - альбумин, казеин. Благодаря такому составу молоко представляет собой прекрасный субстрат для развития микроорганизмов. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии. Путем использования реакций, которые сопутствуют главному процессу сбраживания лактозы получают и другие продукты переработки молока: сметану, йогурт, сыр и т.д. Свойства конечного продукта зависят от характера и интенсивности реакций ферментации. Те реакции, которые сопутствуют образованию молочной кислоты, определяют обычно особые свойства продуктов. Например, вторичные реакции ферментации, идущие при созревании сыров, определяют вкус отдельных их сортов. В таких реакциях принимают участие пептиды, аминокислоты и жирные кислоты, находящиеся в молоке.

Все технологические процессы производства продуктов из молока делятся на две части: 1) первичная переработка - уничтожение побочной микрофлоры; 2) вторичная переработка. Первичная переработка молока включает в себя несколько этапов. Сначала молоко очищается от механических примесей и охлаждается, чтобы замедлить развитие естественной микрофлоры. Затем молоко сепарируется (при производстве сливок) или гомогенизируется. После этого проводят пастеризацию молока, при этом температура поднимается до 80 о С, и оно закачивается в танки или ферментеры. Вторичная переработка молока может идти двумя путями: с использованием микроорганизмов и с использованием ферментов. С использованием микроорганизмов выпускают кефир, сметану, творог, простокваши, казеин, сыры, биофруктолакт, биолакт, с использованием ферментов - пищевой гидролизат казеина, сухую молочную смесь для коктейлей и т.д. При внесении микроорганизмов в молоко лактоза гидролизуется до глюкозы и галактозы, глюкоза превращается в молочную кислоту, кислотность молока повышается, и при рН 4-6 казеин коагулирует.

Молочнокислое брожение бывает гомоферментативным и гетероферментативным. При гомоферментативном брожении основным продуктом является молочная кислота. При гетероферментативном брожении образуются диацетил (придающий вкус сливочному маслу), спирты, эфиры, летучие жирные кислоты. Одновременно идут протеолитические и липолитические процессы, что делает белки молока более доступными и обогащает дополнительными вкусовыми веществами.

Для процессов ферментации молока используются чистые культуры микроорганизмов, называемые заквасками. Исключение составляют закваски для кефиров, которые представляют естественный симбиоз нескольких видов молочнокислых грибков и молочнокислых бактерий. Этот симбиоз в лабораторных условиях воспроизвести не удалось, поэтому поддерживается культура, выделенная из природных источников. При подборе культур для заквасок придерживаются следующих требований:

Состав заквасок зависит от конечного продукта (например, для получения ацидофилина используется ацидофильная палочка, для производства простокваши - молочнокислые стрептококки);

Штаммы должны отвечать определенным вкусовым требованиям;

Продукты должны иметь соответствующую консистенцию, от ломкой крупитчатой до вязкой, сметанообразной;

Определенная активность кислотообразования;

Фагорезистентность штаммов (устойчивость к бактериофагам);

Способность к синерезису (свойству сгустка отдавать влагу);

Образование ароматических веществ;

Сочетаемость штаммов (без антагонизма между культурами);

Наличие антибиотических свойств, т.е. бактериостатическое действие по отношению к патогенным микроорганизмам;

Устойчивость к высушиванию.

Культуры для заквасок выделяются из природных источников, после чего проводится направленный мутагенез и отбор штаммов, отвечающих перечисленным выше требованиям. Биотехнологии на основе молока включают, как правило, все основные стадии биотехнологического производства, которые можно рассмотреть на примере сыроварения.

Учебно-методическое пособие для студентов специальности

050701 «Биотехнология»

Шымкент, 2007

УДК 631. 147(075.8)

ББК 30. 16я 73

Составили: Приходько Н. А., Есимова А. М., Надирова Ж.К.

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА. КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ. Учебно-методическое пособие для студентов специальности 050701 «Биотехнология» – Шымкент: ЮКГУ им. М. Ауезова,- 2007.- 100с.

Рис. 22, табл. 9, список литературы 15 наим.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов III курса дневной и заочной формы обучения по специальности 050701 «Биотехнология» и включает 8 лекций, содержание которых охватывает программу курса в соответствии с Государственным общеобязательным стандартом образования Республики Казахстан.

Учебно-методическое пособие составлено на основании Государственных общеобязательных стандартов образования РК (Астана, 2001, 2004 (ГОСО РК 3.07.078 – 2001 и ГОСО РК 3.08. – 076 – 2004)

Рецензенты: доцент кафедры биотехнология

к. х. н. Тасыбаева Ш.Б..

© Южно-Казахстанский Государственный университет им. М. Ауезова

Введение

1. Цель, задачи и место дисциплины в учебном процессе

Настоящий курс предназначен для студентов бакалавриата, обучающихся по специальности 050701 – биотехнология. В нем детально рассматриваются основные этапы

В программе освещены вопросы, касающиеся биообъектов, биохимических процессов и сырья биотехнологических производств. Дана характеристика типов культивирования микроорганизмов, способов выделения и очистки конечных продуктов. Особое внимание уделяется значению методов генной инженерии в современной биотехнологии.

Цель курса – ознакомить студентов с основными этапами биотехнологических производств, включая:

Виды сырья;

основой биопроизводств;

Задачи курса

биотехнологических производств.

Минимальная трудоемкость дисциплины по типовому учебному плану составляет 90 часов.

Лекция 1. Введение. Предмет и задачи курса. Биотехнологическое производство как биоиндустрия. Место приложения научных достижений биотехнологии. Перспективы биотехнологических производств

Форма проведения лекции: вводная с проблемными ситуациями

План лекции

1. Введение

2. Предмет и задачи курса

3. Биотехнологическое производство как биоиндустрия

4. Место приложения научных достижений биотехнологии

5. Перспективы биотехнологических производств

1. Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности. Эти технологии базируются на использовании каталитического потенциала различных биологических агентов и систем – микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток. В настоящее время разработка и освоение биотехнологии занимают важное место в деятельности практически всех стран. Достижение превосходства в биотехнологии является одной их центральных задач в экономической политике развитых стран. Лидерами биотехнологии являются сегодня США и Япония, накопившие многолетний опыт биотехнологий для сельского хозяйства, фармацевтической, пищевой и химической промышленности. Прочное положение в производстве ферментных препаратов, аминокислот, белка, медикаментов занимают страны Западной Европы (ФРГ, Франция, Великобритания), а также Россия. Эти страны характеризуются мощным потенциалом новой техники и технологии, интенсивными фундаментальными и прикладными исследованиями в различных областях биотехнологии. Определить сегодня, что же такое биотехнология, весьма не просто. Вместе с тем, само появление этого термина в нашем словаре глубоко символично. Оно отражает мнение, что применение биотехнологических материалов и принципов в ближайшие годы радикально изменит многие отрасли промышленности и само человеческое общество. Интерес к этой науке и темпы ее развития в последние годы растут очень быстро. Человек использовал биотехнологию многие тысячи лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб, получали кисломолочные продукты, применяли ферментации для получения лекарственных веществ и переработки отходов. Но только новейшие методы биотехнологии, включая методы генетической инженерии, основанные на работе с рекомбинантными ДНК, привели к «биотехнологическому буму», свидетелями которого являемся мы в настоящее время. Новейшие технологии генетической инженерии позволяют существенно усовершенствовать традиционные биотехнологические процессы, а также получать принципиально новыми, ранее недоступными способами разнообразные ценные продукты. Развитие и преобразование биотехнологии обусловлено глубокими переменами, происшедшими в биологии в течение последних 25–30 лет. Основу этих событий составили новые представления в области наследственности и методические усовершенствования, которые приблизили человечество к познанию превращений ее материального субстрата и проложили дорогу новейшим промышленным процессам. Помимо этого, ряд важнейших открытий в других областях также повлиял на развитие биотехнологии

Генетическая инженерия существует немногим более 20 лет. Она блестяще раскрыла свои возможности в области прокариотических организмов. Однако новые технологии, применяемые к высшим растениям и животным, пока не столь значительны. Попытки применения приемов генетической инженерии к высшим растениям и животным сталкиваются с огромными трудностями, обусловленными как несовершенством наших знаний по генетике эукариот, так и сложностью организации высших организмов.

Использование научных достижений и практические успехи биотехнологии тесно связаны с фундаментальными исследованиями и реализуется на самом высоком уровне современной науки. В этом плане нельзя не отметить удивительную научную многоликость биотехнологии: ее развитие и достижения теснейшим образом связаны и зависят от комплекса знаний не только наук биологического профиля, но также и многих других

Сегодня биотехнология стремительно выдвинулась на передние позиции научно-технического прогресса. Фундаментальные исследования жизненных явлений на клеточном и молекулярном уровнях привели к появлению принципиально новых технологий и получению новых продуктов. Традиционные биотехнологические процессы, основанные на брожении, дополняются новыми эффективными процессами получения белков, аминокислот, антибиотиков, ферментов, витаминов, органических кислот и др. Наступила эра новейшей биотехнологии, связанная с получением вакцин, гормонов, интерферонов и др. Важнейшими задачами, стоящими перед биотехнологией сегодня, являются: повышение продуктивности сельскохозяйственных растительных культур и животных, создание новых пород культивируемых в сельском хозяйстве видов, защита окружающей среды и утилизация отходов, создание новых экологически чистых процессов преобразования энергии и получения минеральных ресурсов.

Характеризуя перспективы и роль биотехнологии в человеческом обществе, уместно прибегнуть к высказыванию на одном из Симпозиумов по биотехнологии японского профессора К. Сакагучи, который говорил следующее: «... ищите все, что пожелаете, у микроорганизмов, и они не подведут вас... Изучение и применение в промышленности культур клеток млекопитающих и растений, иммобилизация не только одноклеточных, но и клеток многоклеточных организмов, развитие энзимологии, генетической инженерии, вмешательство в сложный и недостаточно изученный наследственный аппарат растений и животных все больше расширят области применения существующих направлений биотехнологии и создадут принципиально новые направления».

2. Современный этап научно-технического прогресса характеризуется революционными изменениями в биологии, которая становится лидером естествознания. Биология вышла на молекулярный и субклеточный уровень, в ней интенсивно применяются методы смежных наук (физики, химии, математики, кибернетики и др.), системные подходы. Бурное развитие комплекса наук биологического профиля с расширением практической сферы их применения обусловлено также социально-экономическими потребностями общества. Такие актуальные проблемы, стоящие перед человечеством второй половины ХХ века, как дефицит чистой воды и пищевых веществ (в особенности белковых), загрязнение окружающей среды, недостаток сырьевых и энергетических ресурсов, необходимость развития новых средств диагностики и лечения, не могут быть решены традиционными методами. Поэтому возникла острая необходимость в разработке и внедрение принципиально новых методов и технологий. Большая роль в решение комплекса этих проблем отводится биотехнологии, в рамках которой осуществляется целевое применение биологических систем и процессов в различных сферах человеческой деятельности. Цель курса – ознакомить студентов с основными этапами биотехнологических производств, включая:

Виды сырья;

Биообъекты – клетки и ферменты, биохимическая активность которых является

основой биопроизводств;

Процессы, лежащие в основе этих производств;

Выделение, очистка и товарные формы конечных продуктов.

Задачи курса

Показать уникальные возможности микроорганизмов и разнообразие

ферментативных реакций, лежащих в основе биопроизводств;

Дать характеристику сырья, в том числе, недефицитных вторичных

продуктов и отходов ряда производств;

Ознакомить с методами культивирования микроорганизмов;

Дать характеристику этапам получения конечных продуктов

биотехнологических производств.

3. В современной биотехнологии в соответствии со спецификой сфер ее применения целесообразно выделить в качестве самостоятельных ряд разделов следующие:

Промышленная микробиология;

Медицинская биотехнология;

Технологическая биоэнергетика,

Сельскохозяйственная биотехнология;

Биогидрометаллургия;

Инженерная энзимология;

Клеточная и генетическая инженерия;

Экологическая биотехнология.

Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов в различных сферах человеческой деятельности, от получения пищи и напитков до воспроизводства экологически чистых энергоносителей и новых материалов обусловлена их компактностью и одновременно крупномасштабностью, высоким уровнем механизации и производительности труда. Эти процессы поддаются контролю, регулированию и автоматизации. Биотехнологические процессы, в отличие от химических, реализуются в «мягких» условиях, при нормальном давлении, активной реакции и невысоких температурах среды; они в меньшей степени загрязняют окружающую среду отходами и побочными продуктами, мало зависят от климатических и погодных условий, не требуют больших земельных площадей, не нуждаются в применении пестицидов, гербицидов и других, чужеродных для окружающей среды агентов. Поэтому биотехнология в целом и ее отдельные разделы находится в ряду наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса и является ярким примером «высоких технологий», с которыми связывают перспективы развития многих производств. Биологические технологии находятся в настоящее время в фазе бурного развития, но уровень их развития во многом определяется научно-техническим потенциалом страны. Все высокоразвитые страны мира относят биотехнологию к одной из важнейших современных отраслей, считая ее ключевым методом реконструкции промышленности в соответствии с потребностями времени, и принимают меры по стимулированию ее развития.

Биотехнологические процессы многолики по своим историческим корням и по своей структуре, они объединяют элементы фундаментальных наук, а также ряда прикладных отраслей, таких как химическая технология, машиностроение, экономика. Научная многоликость биотехнологии в целом и ее раздела, имеющего целью решение природоохранных задач, удивительна: они использует достижения наук биологического цикла, изучающих надорганизменный уровень (экология), биологические организмы (микробиология, микология), суборганизменные структуры (молекулярная биология, генетика). Через биологию на биотехнологию влияют химия, физика, математика, кибернетика, механика. Современные биотехнологии также остро нуждаются в научно-обоснованной проработке технологии и аппаратурном оформлении. Поэтому необходима органическая связь с техническими науками – машиностроением, электроникой, автоматикой. Общественные и экономические науки также имеют большое значение в развитии экологической биотехнологии, так как решаемые ею практические задачи имеют большое социально-экономическое значение для развития любого общества. К биотехнологии, как ни к одной любой отрасли и области научных знаний, подходят знаменитые слова Луи Пастера: «Нет, и еще тысячу раз нет, я не знаю такой науки, которую можно было бы назвать прикладной. Есть наука и есть области ее применения, и они связаны друг с другом, как плод с взрастившим его деревом».

Современном биологическим технологиям под силу создать отрасли, основанные на функционировании биологических систем, метаболические системы которых обладают уникальными достоинствами и подчинены интересам человечества.

5. Области применения биотехнологии очень разнообразны, она охватывает множество наук и производств, поэтому в настоящее время принято различать следующие виды биотехнологий.

Пищевая биотехнология Это наиболее старое и традиционное использование способностей микроорганизмов в получении пива, вина, кисломолочных продуктов, дрожжей и т.д. С развитием науки будут совершенствоваться два направления:

Производство микроорганизмов, клеток растений и животных в биореакторах, при этом выход будет существенно выше, чем в сельском хозяйстве;

Повышение производительности биотехнологических процессов за счет использования методов генной инженерии.

Таблица 2 - Эффективность биоконверсии сырья

Медицинская биотехнология. Получила развитие благодаря достижениям генной инженерии, например, получение интерферона, инсулина, гормонов роста путем клонирования генов человека в микроорганизмы, широко используются в терапии и диагностике различные ферменты. В будущем будут использованы достижения биоэлектрохимии, например, создаются специальные датчики, определяющие содержание глюкозы, нервных газов, отдельных компонентов крови.

Сельскохозяйственная биотехнология. В данном случае применение очень разнообразно:

Использование продукции и отходов сельского хозяйства в качестве сырья для получения биотехнологических продуктов: спирт, вино, пиво, энергия. Для развития этого направления надо тщательно изучить кинетику разложения различных субстратов и роль микроорганизмов в процессах;

Использование биотехнологии в ветеринарии для получения вакцин и сывороток;

Получение корма для скота: БВК, дрожжевая масса;

Новые способы улучшения сельскохозяйственных культур по урожайности и качеству;

Использование методов биологической фиксации азота вместо традиционных удобрений;

Использование методов биологического контроля вместо пестицидов.

Будущее сельскохозяйственной биотехнологии – это улучшение свойств растений путем использования генной инженерии.

Промышленная биотехнология. Энергетика: солнце → биомасса → энергия. В будущем будут созданы биотопливные элементы, например, водород, образующийся при брожении, используется в кислородно-водородном элементе. Необходимо повысить эффективность конверсии солнечного света в биомассу (обычно это 1 - 2%). Решаются также вопросы получения Н 2 путем расщепления Н 2 О фотосинтезирующими микроорганизмами (сине-зеленые водоросли). Перспективно использование микроорганизмов в нефтедобывающей промышленности как ПАВ или полимеры.

Химические соединения. Биохимический способ их получения имеет преимущества: специфичность, легкость контроля, низкие температуры, экологичность, простота. Можно получать спирт, метан, кислоты, ацетон, аминокислоты, ферменты, антибиотики и др. Но пока традиционные способы синтеза преобладают. В будущем планируется производство пластмасс, эмульгаторов и загустителей. Материалы.

Биотехнология способствует развитию добычи промышленного сырья, например нефти;

Микроорганизмы используют для производства многих материалов, например, пластмасс;

Разрабатываются способы защиты различных веществ от разрушения микроорганизмами;

Микробиологическое выщелачивание руд.

Экологическая биотехнология. Давно известны и широко применяются микробиологические способы очистки сточных вод и переработки отходов. Перспектива – использование микроорганизмов с ранее известными или искусственно созданными катаболическими способностями.

Биодатчики для мониторинга и контроля окружающей сферы.

Таблица 3 - Экономические и коммерческие аспекты биотехнологии. Оценка спроса на мировом рынке в 2010 году на различные продукты «новой» биотехнологии

Это в 6 раз больше, чем дает сейчас бродильная промышленность.

Связь микробиологии с химическими технологиями дала результаты, с внедрением биотехнологии в промышленность произойдет переход от тяжелой индустрии к высоким технологиям. Внедрение биотехнологии в практику изменяет соотношение в системе: человек- производство- природа, повышает производительность труда. Широкое использование биотехнологических процессов способствует стиранию грани между промышленным и сельским производством, поскольку продукты питания, корма и другие сельскохозяйственные продукты вырабатываются в индустриальных условиях. В настоящее время достижения биотехнологии перспективно использовать в следующих отраслях:

В промышленности (химическая, нефтяная, фармацевтическая, пищевая);

В экологии;

В энергетике;

В сельском хозяйстве;

В медицине.

Биотехнология - межотраслевая дисциплина и ее развитие невозможно без открытий в других отраслях и дисциплинах. Бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики, опирающихся на достижения химии и физики, позволяет использовать потенциал живых организмов в интересах хозяйственной деятельности человека (т.е. они изучают жизненные явления на клеточном и молекулярном уровне). Клеточная и генная инженерия позволяет получать новые штаммы-продуценты.

Вопросы для самопроверки

1. Какие преимущества имеют биотехнологические методы

2. В каких направлениях наиболее перспективно развитие биотехнологии

3. Какими принципами регламентируется выбор объектов биотехнологии

4. Связь микробиологии с химическими технологиями

5. Будущее сельскохозяйственной биотехнологии

6. Внедрение биотехнологии в практику

7. Наиболее старое и традиционное использование способностей микроорганизмов

8. Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов

Лекция 2. Значение микроорганизмов как объектов биотехнологических производств. Своеобразие и скорость обмена веществ у микроорганизмов. Использование в биотехнологии мутантных и гибридных продуцентов

Форма проведения лекции: проблемная

План лекции

1. Значение микроорганизмов как объектов биотехнологических производств

2. Своеобразие и скорость обмена веществ у микроорганизмов

3. Теоретические основы процесса селекции

4. Выбор исходного микроорганизма для селекции

5. Подготовка селекционного материала к селекционной работе

6. Получение мутантов

7. Отбор положительных мутантов

1. Биологический агент является активным началом в биотехнологических процессах и одним из наиболее важных ее элементов. Номенклатура биологических агентов бурно расширяется, но до настоящего времени важнейшее место занимает традиционный объект – микробная клетка.

Микробные клетки с различными химико-технологическими свойствами могут быть выделены из природных источников и далее с помощью традиционных (селекция, отбор) и новейших методов (клеточная и генетическая инженерия) существенно модифицированы и улучшены. При выборе биологического агента и постановке его на производство прежде всего следует соблюдать принцип технологичности штаммов. Это значит, что микробная клетка, популяция или сообщество особей должны сохранять свои основные физиолого-биохимические свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты также должны обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам, заражению посторонней микрофлорой (контаминации); характеризоваться безвредностью для людей и окружающей среды, не иметь при выращивании побочных токсичных продуктов обмена и отходов, иметь высокие выходы продукта и приемлемые технико-экономические показатели.

В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы – организмы, развивающиеся в экстремальных условиях среды (термофильные, алкало- и ацидофильные). В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами, микробные ассоциации. способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур – охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов. Особая группа биологических агентов в биотехнологии – ферменты, так называемые катализаторы биологического происхождения. Ферменты находят все большее применение в различных биотехнологических процессах и отраслях хозяйствования, но до 60-х годов это направление сдерживалось трудностями их получения, неустойчивостью, высокой стоимостью. Как отдельную отрасль в создании и использовании новых биологических агентов следует выделить иммобилизованные ферменты, которые представляют собой гармонично функционирующую систему, действие которой определяется правильным выбором фермента, носителя и способа иммобилизации. Преимущество мобилизованных ферментов в сравнении с растворимыми заключается в следующем: стабильность и повышенная активность, удержание в объеме реактора, возможность полного и быстрого отделения целевых продуктов и организации непрерывных процессов ферментации с многократным использованием биологического агента. Иммобилизованные ферменты открывают новые возможности в создании биологических микроустройств для использования в аналитике, преобразовании энергии и биоэлектрокатализе. К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития биотехнологии относят растительные и животные ткани, в том числе гибридомы, трансплантанты. Большое внимание в настоящее время уделяется получению новейших биологических агентов – трансгенных клеток микроорганизмов, растений, животных генноинженерными методами. Развиты также новые методы, позволяющие получать искусственные клетки с использованием различных синтетических и биологических материалов (мембраны с заданными свойствами, изотопы, магнитные материалы, антитела). Разрабатываются подходы к конструированию ферментов с заданными свойствами, имеющими повышенную реакционную активность и стабильность. В настоящее время реализован синтез полипептидов желаемой стереоконфигурации и пр.

Таблица 4 - Микрооорганизмы, используемые в промышленности
для получения целевых продуктов

Организм	Тип	Продукт
Saccharomyces cerevisiae	Дрожжи	Пекарские дрожжи, вино, эль, саке
Streptococcus thermophilus Propionibacterium shermanii	Бактерии Бактерии	Иогурт Швейцарский сыр
Gluconobacterium suboxidans	Бактерии	Уксус
Penicillium roquefortii	Плесень	Сыры типа рокфора
Aspergillus oryzae	Плесень	Саке
Saccharomyces cerevisiae	Дрожжи	Этанол
Clostridium acetobutylicum	Бактерии	Ацетон
Xanthomonas campestris	Бактерии	Полисахариды
Corynebacterium glutamicum	Бактерии	L-Лизин
Candida utilis	Дрожжи	Микробный белок
Propionibacterium	Бактерии	Витамин В 12
Aspergilus oryzae	Плесень	Амилаза
Kluyveromyces fragilis	Дрожжи	Лактаза
Saccharomycopsis lipolytica	Дрожжи	Липаза
Bacillus	Бактерии	Протеазы
Endothia parasitica	Плесень	Сычужный фермент
Leocanostoc mesenteroides	Бактерии	Декстран
Xanthomonas campestris	Бактерии	Ксантан
Penicillium chrysogenum	Плесень	Пенициллины
Chehalosporium acremonium	Плесень	Цефалоспирины
Rhizopus nigricans	Плесень	Трансформация стероидов
Гибридомы	–	Иммуноглобулины и моноклональные антитела
Клеточные линии млекопитающих	–	Интерферон
E. coli (рекомбинантные штаммы)	Бактерии	Инсулин, гормон роста, интерферон
Blakeslea trispora	Плесень	b-Каратин
Phaffia rhodozyma	Дрожжи	Астаксантин
Bacillus thuringiensis	Бактерии	Биоинсектициды
Bacillus popilliae	Бактерии	Биоинсектициды

Таблица 5 - Важнейшие группы субстратов, биологических агентов и образуемых в биотехнологических процессах продуктов Субстраты Биологические агенты Продукты Меласса, сок сахарного тростника, гидролизаты растительных полимеров. Микроорганизмы, растительные и животные клетки, . Биоудобрения и биоинсектициды, микробные биомассы, диагностикумы, вакцины. Сахара, спирты, органические кислоты. Парафины нефти. Полупродукты, предшественники биотрансформации. Природный газ, водород. Отходы с/х и лесной промышленности. Отходы промышленности, в том числе переработки фруктов и овощей. Бытовые отходы, сточные воды. Молочная сыворотка. Картофель, зерно. Зеленая биомасса растений. Вирусы. Компоненты клеток: мембраны, протопласты, митохондрии, ферменты. Внеклеточные продукты: ферменты, коферменты. Иммобилизованные клетки микроорганизмов, растений и животных, их компоненты и внеклеточные продукты. Биогаз. Чистые продукты, медикаменты, диагностикумы. Гормоны и др. продукты биотрансформации Органические кислоты. Полисахариды. белок одноклеточных. Пищевые продукты. Экстракты, гидролизаты. Спирты, органические растворители. Антибиотики Аминокислоты. Ферменты, витамины. Металлы, неметаллы. Моноклональные антитела.

Таким образом, в биотехнологических процессах возможно использование различных биологических агентов с различным уровнем организации, – от клеточной до молекулярной.

2. Все биотехнологические процессы в биотехнологии микроорганизмов основываются на функционировании микробных клеток, поэтому биотехнология начинается с познания живой клетки и законов управления процессами жизнедеятельности. По своему строению микробные клетки бывают прокариотические (бактерии сине-зелёные водоросли) и эукариотические (грибы, водоросли, простейшие). Живая клетка- сложный химический реактор, в котором протекает более 1000-чи независимых реакций, катализируемых ферментами. Тем не менее биологической системы подчиняются тем же основным законам сохранения вещества и энергии и тем же принципам, что и процессы химической технологии. Микроорганизмы могут усваивать световую энергию - фототрофы и химическую - хемотрофы. Гетеротрофы могут усваивать только органические вещества, а афтотрофы не органические вещества (например СО2).

Полученная энергия хранится и транспортируется внутри клетки в виде высокоэнергетических соединений типа АТФ, а клетки используют энергию для выполнения 3-х функций:

1. для роста, для синтеза больших, сложных молекул

2. транспорта ионных и нейтральных соединений

3. механической работы, то есть деление и передвижение

Эффективность использования энергии в биосинтезе высокая, остальная энергия превращается в тепло.

Метаболизм – это совокупность всех химических превращений клетки.

Метаболизм складывается из катаболизма (распад веществ, разложение химических веществ для получения энергии) и анаболизма (образования сложных веществ клетки из простых, с затратами энергии) амфиболизм (все реакции промежуточного обмена)

Микроорганизмы бывают аэробные (требуется О2 для дыхания) и анаэробные (существуют без кислорода). При анаэробном расщеплении (брожении) органические вещества не разлагаются до простых конечных, по этому энергии высвобождается мало. При аэробном обмене (дыхании) получаются бедные энергией конечные продукты (СО2 и Н2О) и высвобождается много энергии

Брожение (спиртовое):

С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ = 2С2Н5ОН + 2АТФ +2СО2

С6Н12О6 + 6О2 + 36Н3РО4 + 36АДФ = 6СО2 + 6Н2О + 36АТФ + 36Н2О

Таким образом из 1 моля глюкозы при дыхании образуется 36 моль АТФ и 2847 кДж, а при анаэробном процессе только 2 моли АТФ и 217 кДж, то есть в 18 раз меньше. По этому в аэробных условиях рост клеток более эффективен

При дыхании водород получаемый в результате гликолиза, транспортируется к кислороду. В результате гликолиза из одной молекулы глюкозы образуется по две молекулы пирувата, АТФ и NADH2. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию при участии мультиферментного комплекса и нескольких коферментов. Один кофермент принимает отщеплённый водород, а другой кофермент А(СоА-Н) присоединяет оставшуюся ацетильную группу СоСН2.

При дыхании ацетильный остаток полностью расщепляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) в результате окисления и отщепления Н, декарбоксилирования (отщепления СО2) и гидратации (присоединения Н2О).

Основную энергию для синтеза АТФ при дыхании клетка получает в результате окисления кислородом водорода, получаемого в результате гликолиза, окисления пирувата и реакции ЦТК. Последняя стадия катаболизма – окислительное фосфорилирование. В ходе этого процесса высвобождается большая часть метаболической энергии, при этом молекулы NADH и FADH2 переносят электроны от молекулы питательных веществ к молекуле О 2. Фосфорилирование осуществляется в дыхательной цепи под воздействием фермента АТФ-синтетазы

В цепи дыхания при переносе Н от NAD H к О2 освобождается 218 кдж на 1-моль NAD H.

Ассимиляция (анаболизм) у автотрофных и гетеротрофных организмов.

Ассимиляция – синтез собственных веществ тела из неорганических (СО2, Н2О, NH3-автотрофная) или из органических соединений (гетеротрофная).

Потребность в энергии удовлетворяется либо за счет световой энергией в процессе фотосинтеза, либо за счет окисления неорганических веществ (H2S,NH3 и др.) в процессе хемосинтеза.

Фотосинтез-преобразование энергии света в химическую, которая накапливается в форме АТФ и водорода связанного с коферментом (NAD H).

Он состоит из 2-х процессов: светового – преобразования энергии, фотонов hv и темнового - образования углеводов.

Восстановитель Н2 образуется при разложении Н2О при фотосинтезе:

12Н2О hv 12 Н2+6О2+АТФ

АТФ синтезируется при прохождении электронов по цепи транспорта электронов

6СО2+12Н2 в темноте С6Н12О6+6Н2О.

Бактериальные и растительные клетки сами синтезируют все 20 аминокислот, входящих в состав белков (в зеленых клетках в хлоропластах)

Гетеротрофная ассимиляция сводится в основном к процессам перестройки молекул, иногда организму достаточного только одного органического вещества, чтобы синтезировать все необходимые соединения, другие же организмы должны получать совершено определённые, незаменимые вещества, например аминокислоты и витамины и др.

3. Промышленно важные продукты жизнедеятельности микроорганизмов по их природе и значению для самой микробной клетки делят на три основные группы:

Крупные молекулы (ферменты, полисахариды с молекулярной массой от 10 тыс. до нескольких миллионов);

Первичные метаболиты (соединения, необходимые микроорганизмам для роста: аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, витамины и др.);

Вторичные метаболиты (соединения, ненужные микроорганизмам для роста: антибиотики, токсины, алкалоиды, факторы роста растений).

Первичные и вторичные метаболиты микробного происхождения обычно имеют довольно низкую по сравнению с ферментами молекулярную массу менее 1,5 тыс.

Биологическую активность эти вещества проявляют различно: удовлетворяют потребности человека и животных, взаимодействуют с микроорганизмами, насекомыми, растениями, участ­вует в разложении различных органических субстратов. Кроме того, некоторые аминокислоты могут служить сырьем для дальнейших превращений на основе химического синтеза.

Продукты микробного синтеза для того, чтобы стать объектом рентабельного промышленного производства, должны выделяться микробной клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в количествах, которые оправдывали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование микроорганизма и выделение продукта в необходимой для дальнейшего использования форме. В большинстве случаев выбор микробиологиче­ского способа получения того или иного вещества обусловлен полным отсутствием или весьма ограниченной возможностью по­лучения его другими способами, в первую очередь путем химиче­ского синтеза. Многие антибиотики, ферменты, биологически активные изомеры ряда аминокислот, пуриновые нуклеотиды, токсины, факторы роста растений в настоящее время возможно или, по крайней мере, гораздо проще получать с помощью микро­организмов из доступного и дешевого сырья, чем осуществлять сложный, многоэтапный химический синтез, или даже один-два этапа ферментативного синтеза, но на основе сложного и часто малодоступного сырья.

Однако природные штаммы микроорганизмов, как правило, не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде, т. е. продуцировать, такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы достаточно низкую его стоимость и требуемый объем производства. Природные штаммы некоторых групп микроорганизмов (несовершенные грибы, актиномицеты, бациллы) способны выделять в окружающую среду сравнительно небольшие количества антибиотиков, токсинов или гидролитических ферментов. Первичные метаболиты, как правило, микроорганизмами не выделяются в значительном количестве (синтезируемое количество этих веществ строго ограничено и рассчитано на потребности самой клетки). Исключение из этого правила - выделение глутаминовой кислоты природными штаммами (так называемой группы глутаматпродуцирующих коринебактерий) - не распростра­няется на подавляющее большинство других аминокислот.

В связи с этим задача селекционера - не только усиление природной способности микроорганизма продуцировать опреде­ленное вещество (антибиотик, фермент, токсин и др.), но во многих случаях и создание продуцента «заново» из штамма дикого типа, способного синтезировать вещество (например, аминокислоту), но не способного его продуцировать. Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов наследствен­ных изменений - мутаций, приводящих к усилению природной способности микроорганизмов синтезировать и продуцировать определенное вещество, а также появлению новой способности - синтезировать вещество в избытке - сверх своих потребностей и продуцировать его.

Дальнейшее повышение уровня продукции того или иного вещества у микроорганизма - это постоянная цель работы селекционеров, так как наиболее эффективный способ интенси­фикации микробиологического производства, не требующий дополнительных капиталовложений, заключается в использова­нии более продуктивного штамма.

Синтез микроорганизмами первичных или вторичных метабо­литов можно представить себе как процесс, начинающийся с поглощения клеткой субстрата (источников углерода и азота, микроэлементов и т. д.) и проходящий затем ряд этапов, катализируемых различными ферментами, часть которых участ­вует в регуляции синтеза нужного вещества или его предшест­венников. На отдельных этапах промежуточные вещества могут служить предшественниками других метаболитов и расходовать­ся на их синтез. Предшественники определенного вещества могут быть промежуточными или конечными продуктами других путей синтеза, иметь собственную регуляцию и расходоваться на другие потребности клетки. Кроме того, продуцируемое вещество должно преодолевать барьер проницаемости и накапливаться в среде культивирования, не подвергаясь деградации под действием ферментов, которые может синтезировать микробная клетка.

Теоретически мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в различных изменениях метаболизма клетки:

Повышение скорости поглощения и утилизации субстрата клеткой;

Повышение уровня синтеза биосинтетических ферментов или их активности, в частности, за счет нарушения негативного контроля синтеза и активности регуляторных ферментов в пути синтеза продукта или его предшественников;

Блокирование побочных реакций синтеза для снижения расхода общих предшественников на синтез других метаболитов;

Блокирование дальнейшего внутриклеточного превращения продукта, если оно происходит;

Обеспечение эффективной экскреции продукта из клетки;

Блокирование деградации продукта;

Усиление позитивных форм регуляции синтеза продукта.

Если желаемым продуктом является выделяемый клеткой фермент (чаще всего это гидролитические ферменты, хотя в последнее время большой интерес проявляется и к ряду оксидоредуктаз, в частности, участвующих в катаболизме аминокислот), то мутации, способствующие усилению его образования и активности, а также накоплению в среде, могут затрагивать:

Структурный ген, приводя к синтезу мутантного фермента, не чувствительного к ингибированию конечным продуктом реакции, и (или) повышая его активность (число оборотов, т. е. число молей превращаемого субстрата в минуту); мутация в промоторной части гена должна усилить частоту инициации транскрипции или вызвать синтез фермента;

Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции синтеза данного фермента (в частности, по типу катаболитной репрессии, имеющей разнообразные формы проявления и в общем виде выражающейся в обратной зависимости синтеза катаболитчувствительного фермента от скорости роста клеток), мутации в этих генах должны устранить или ослабить факторы, ограничивающие синтез фермента;

Гены, кодирующие ферменты, которые могут гидролизовать и инактивировать нужный фермент, мутации должны уменьшить или устранить такую возможность;

Гены, ответственные за синтез компонентов клеточных мембран, которые участвуют в «сборке» (у эукариотов) и экскреции ферментов, мутации в этих генах могут повысить эффективность указанных процессов.

Приведенный перечень теоретически возможных, «участвующих» в сверхсинтезе мутаций, очевидно, не полон, так как наши сведения о регуляции биосинтеза того или иного метаболита и взаимосвязях с другими процессами в клетке не являются исчерпывающими, не любая из перечисленных мутаций может вызвать сверхсинтез. Чаще всего требуется сочетание нескольких мутаций, среди которых могут быть «главные» и «вспомогательные». Последние необходимы для проявления или наибольшего выражения первых. Вместе с тем возможно и отсутствие значительного уровня продукции даже в случае, когда большинство из теоретически необходимых для этого мутаций получено у микроорганизма и, наоборот, селекционер может быть избавлен от необходимости получать множество разных мутаций, если он удачно выбрал исходный природный тип микроорганизмов.

4. Разнообразие природных форм позволяет выбрать микроорганизм, который имеет меньшее число ограничений для сверхсинтеза какого-то вещества, хотя при этом и не продуцирует его. Так, оказалось очень сложным и на практике пока еще недостижимым получить промышленно значимый уровень продукции L-лизина у кишечной палочки или псевдомонад, но весьма легким у представителей глутаматпродуцирующих коринебактерий: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavит и др. Исходя из имеющихся данных, объяснить это можно менее сложной регуляцией синтеза лизина у коринебактерий (в процессе синтеза лизина всего один фермент контролируется по типу поливалентного ингибирования активности лизином и треонином, и этот контроль устраняется мутацией, блокирующей синтез гомосерина - предшественника треонина и метионина, при этом поток общих предшественников направляется только на синтез лизина), а также отсутствием деградации лизина по сравнению с регуляцией у кишечной палочки (три контролируемых фермента и более сложные формы регуляции) и выраженной способностью к деградации лизина у псевдомонад.

В ряде случаев природные штаммы с менее сложными системами ограничений сверхсинтеза выделяют в среду некоторое количество первичного метаболита, например, штамм гриба Еremothecium ashbyii способен продуцировать витамин В 2 , а Рrоpionibacterium shermanii- B 12 . Такие микроорганизмы, конечно, становятся объектами селекции на повышение уровня продукции выделяемого вещества. Пригодность микроорганизма (не выделяющего нужное вещество, обычно первичный метаболит, но привлекающего исследователя какими-то свойствами) для использования в качестве объекта селекции на получение продуцента этого вещества можно проверить, введя ему одну или несколько определенных, легко тестируемых мутаций, которые теоретически должны вызвать сверхсинтез данного вещества и, может быть, уже были «апробированы» на другом микроорганизме. Это самый надежный способ выбора исходного штамма, даже если для этого вида микроорганизма нет данных о регуляции синтеза желаемого вещества. Для продуцентов вторичных метаболитов, а также ферментов или полисахаридов выбор исходного штамма предрешен способностью природного микроорганизма продуцировать какое-то количество нужного вещества. В тех случаях, когда одно и то же вещество выделяют природные штаммы, относящиеся к разным таксономическим группам (например, грибы и бациллы), это может позволить выбрать более "технологичный" для будущего производства или более поддающийся селекции штамм.

Таким образом, селекционер чаще всего не свободен в выборе исходного для селекции штамма и не может считать критерием такого выбора генетическую изученность микробного объекта и возможность применения к нему разнообразных генетических методов. Природные свойства штаммов, определяющие этот выбор, безусловно, облегчают и ускоряют селекционную работу. Однако отсутствие у многих промышленных микроорганизмов систем обмена информацией не позволяет ни изучить генетический контроль синтеза продуцируемого вещества, ни облегчить насыщение генома продуцента необходимыми для сверхсинтеза мутациями.

5. У микроорганизма, выделяющего продукт и взятого в качестве объекта селекции, необходимо изучить естественную изменчивость по морфологическим признакам и по количественному признаку - уровню продукции желаемого вещества. После рассева исходного штамма на чашки Петри среди не менее 100 (а лучше нескольких сотен) колоний выявляют типичную для данной культуры морфологическую форму и отклонения от нее. Затем изолированные на косяки колонии (клоны) как типичной формы (не менее 100 клонов), так и доступное число ее морфоло­гических вариантов (убедившись предварительно, что эти ва­рианты сохраняют свои особенности при пересевах) оценивают после соответствующего способа культивирования по уровню продукции вещества, применяя надежный аналитический метод. Такая оценка позволяет выявить вполне возможную корреляцию между способностью продуцировать данное вещество и морфологией колоний.

Несколько клонов с наиболее высоким уровнем продукции по отношению к уровню контроля, которым является исходная (не рассевавшаяся) культура, отбирают и проверяют на про­дукцию в нескольких повторных опытах, а затем отбирают один клон, характеризующийся высоким и воспроизводимым уровнем. Такая процедура, которую иногда называют «чисткой» исходной культуры, довольно часто приводит к отбору клона с заметно повышенной продукцией, а в некоторых случаях - и с отклонением от типичной морфологии.

Отобранный из рассева исходной культуры клон снова рассе­вают, отмечают морфологическую изменчивость, если она есть и затем оценивают по уровню продукции не менее 100 типичных для данного клона изолированных на косяки колоний. Целесообразно значения уровней продукции таких субклонов, выражен­ные в процентах по отношению к продукции исходного для них (родительского) клона, распределить в вариационном ряду и вычислить статистические показатели: среднее арифметическое X, квадратическое отклонение, δ коэффициент изменчивости

Субклоны, попавшие в крайнюю правую часть этого ряда, отбирают, повторно оценивают по уровню продукции и оставляют один из них. Этот субклон рассевают и, как и в предыдущем случае, проверив не менее 100 колоний, строят вариационный ряд и вычисляют его показатели. Получив, таким образом, два вариационных ряда, сравнивают значения cv этих рядов. Если эти значения достоверно не различаются, можно подготовку исходного штамма для дальнейшей селекции закончить отбором субклона из первого вариационного ряда, а второй ряд (собственный ряд этого субклона) считать контрольным для следующего этапа селекции с применением мутагенных факторов. При обнаружении у cv второго ряда явной тенденции к уменьшению целесообразно провести еще один этап клонирования, выбрав из правой части второго ряда «лучший» построить третий вариационный ряд на основе его рассева определить cv. Цель такого ступенчатого клонирования - «стабилизи­ровать» исходную культуру по количественному признаку, получив на основе действия стабилизирующего отбора наиболее однородную по данному признаку популяцию как надежный контроль при оценке индуцируемой мутагенами изменчивости и последующем отборе мутантов. Следует иметь в виду, что одно­родность отобранной культуры снижается при многократном пассировании и длительном хранении. Поэтому исходную культу­ру, которая должна служить контролем при отборе мутантов, необходимо поддерживать периодическим клонированием, прово­димым в установленные для данной культуры промежутки времени. Повысить уровень продукции таким клонированием, т. е. отобрать мутант, как правило, не удается. Средний уровень продукции клонов, отбираемых из правой части вариационного ряда, построенного на основе естественной изменчивости культуры, обычно равен среднему уровню продукции родительской культуры.

В том случае, когда исходная культура нужное вещество не продуцирует, следует выбрать из ее рассева колонию, которая по таксономической характеристике полностью соответствует дан­ному виду микроорганизма, и использовать этот клон в дальнейшей работе с применением мутагенов.

6. Разнообразные типы мутации получают с помощью различных физических и химических мутагенных факторов. Биологический материал, подвергаемый воздействию мутагенных факторов, должен быть дискретным и содержать минимальное количество ядер, что позволяет устранить или сократить стадию сегрегации. Обычно это споры, вегетативные клетки или даже обрывки ми­целия у неспорулирующих организмов. Суспензия, содержащая клетки или споры, должна быть по возможности лишена комков - конгломератов, так как мутация в одной из клеток конгломерата при прорастании его на агаризованной среде будет утрачена или в лучшем случае проявится в виде сектора. Комки разбивают на качалке, фильтруют суспензию, но полностью избавиться от их присутствия в обрабатываемой мута­геном суспензии обычно не удается.

Физическими факторами (УФ-излучение и различные виды ионизирующей радиации) обрабатывают водную суспензию спор или клеток. При обработке химическими факторами (чаще всего это алкилирующие агенты: алкилметансульфонаты, алкил-сульфаты, алкилнитрозомочевина, метилнитрозогуанидин и др.) следует соблюдать условия, способствующие максимальному про­явлению мутагенной активности данного вещества. Большую роль в этом отношении играет рН раствора, поэтому обработку проводят в буферных растворах при наиболее эффективных для данного мутагена значениях рН.

У актиномицетов и коринебактерий, обработанных парами диэтилсульфата (для этого достаточно нанести каплю веществ на стенку пробирки с выросшей культурой и выдержать несколько часов в термостате), появляется в несколько раз больше морфологических мутаций, чем после обработки в водном растворе мутагена.

Доза воздействия мутагена выражается в единицах излуче­ния, соответствующих типу радиации. Для химических мутагенов доза характеризуется концентрацией мутагена в обрабатываемой суспензии и экспозицией при определенной температуре. После экспозиции обработку химическим мутагеном прерывают отмыванием материала (применяя осаждение его центрифугированием), помещением в буферную смесь с неоптимальным для мутагенного эффекта значением рН и (или) серией разведений в физиологическом растворе, предшествующей высеву на агаризованную среду. Если при поиске определенных типов мутаций суспензия должна быть высеяна на агар без разведения, то отмывание от мутагена необходимо.

При выборе дозы мутагена ориентируются на выживаемость обрабатываемого микроорганизма, последняя определяется отношением числа колоний, выросших на агаре после мутагенного воздействия, к числу колоний, выросших после посева той же, но не обработанной мутагеном (контрольной) суспензии клеток, выраженных в процентах. Выживаемость зависит как от дозы мутагена, так и от чувствительности данного микроорганизма к летальному эффекту мутагена, причем чувствительность может значительно различаться у нескольких штаммов одного вида микроорганизма. В селекционной работе, как правило используются дозы, обеспечивающие выживаемость клеток в диапазоне от 0,1 до 50 – 80 %.

7. Иногда для этого удаётся использовать естественный отбор. Например, хересные винные дрожжи (Sacharomyces oviformis) , способные переокислить спирт в продукты, придающие вину хересный букет, не размножаются при концентрациях спирта больше 15 %. Культивируя их при постепенном увеличении концентрации спирта до 18 %, удалось выделить штамм, способный к образованию хереса в этих условиях.

Любое биотехнологическое производство и биотехнологический процесс можно классифицировать по ряду параметров, которые приведены ниже в таблице "Классификация биотехнологических процессов".

По характеристике биообъекта Пункт 1	По общности и специфичности биотехнологическихпроцессов Пункт 2	По числу биообъектов Пункт 3	По условиям проведения процесса Пункт 4	По стадиям реализации технологии производства Пункт 5	По целевым продуктам Пункт 6	По механизму образования конечного продукта Пункт 7	По управлению процессом Пункт 8	По типу биотехнологического процесса Пункт 9
Плазмиды, фаги, вирусы растений и млекопитающих Клетки прокариот Клетки эукариот Биомолекулы (ферменты, нуклеиновые кислоты или их компоненты и др.)	Общие Специальные: Микробиотехнология Фитобиотехнология Зообиотехнология	Один (например, иммобилизованный фермент, одна чистая культура - продуцент и т. д.) Два и более (например, иммобилизованная полиферментная система; кефирные зерна – ассоциация бактерий и дрожжей и т. д.)	Нестерильный Стерильный Аэробный Анаэробный Поверхностный Глубинный Периодический Полунепрерывный Непрерывный Твердофазный Газофазный 1-ступенчатый 2-ступенчатый Многоступенчатый	Подготовка оборудования и питательных сред Стерилизация оборудования, питательных сред, воздуха Посев и выращивание (культивирование) биообъекта Выделение, очистка, сушка, стерилизация (при необходимости) продукта Упаковка продукта	Клеточная биомасса Первичные метаболиты Вторичные метаболиты	Биосинтез Биотрансформация	Управляемые Неуправляемые	Простой Совместный Последовательный Ступенчатый

Таблица 1 - 1.2. Характеристика биообъекта по источникам энергии, углерода и доноров электронов:

Группа	Источник			Hoмep и название подгруппы
	энергии	углерода	доноров электронов (водорода)
Фототрофные бактерии	Свет	Неорганический	Неорганические вещества	1.Фотоавтолитотрофы
		Органический	Органические вещества	2.Фотогетероорганотрофы
Хемотрофные бактерии	Химические реакции окисления - восстановления	Неорганический	Неорганические вещества	3.Хемоавтолитотрофы
		Органический	Неорганические вещества	4.Хемогетеролитотрофы
			Органические вещества	5.Хемогетероорганотрофы

Таблица 2 - 1.3 - Характеристика биообъекта по трофике

1.4 - Характеристика биообъекта по способности питаться «живым белком» – по патогенности и взаимоотношений между организмами:

К п. 4 «Классификация биотехнологических процессов по условиям проведения биотехнологического производства»

В биотехнологических производствах по условиям проведения процесса, а именно по фазовому состоянию ингредиентов биотехнологические производства различают на твердофазные процессы , например, при флуидизации или протеинизации грубых кормов на основе соломы злаковых растений с участием некоторых грибов, получение тканевых культур лекарственных растений на уплотненных средах, из которых затем экстрагируют действующие вещества, производство сыра из белков молока и др.; газофазные процессы основаны на использовании газа (например, метана) для получения микробного белка с помощью ассоциаций метилотрофных бактерий.

В биотехнологических производствах по условиям проведения процессов выделяют одноступенчатые, двухступенчатые и многоступенчатые биотехнологические процессы . Одноступенчатые проводятся, например, при получении 6-АПК из бензилпенициллина с помощью пенициллинацилазы, или пенициллинамидазы на колоннах, содержащих иммобилизованный фермент. Двухступенчатые процессы базируются на использовании клеток, находящихся в разном фазовом состоянии (в трофофазе и идиофазе). Так, например, двухступенчатый биотехнологический процесс возможен при получении полисахарида курдлана - на первой ступени выращивают продуцент (Alcaligenes faecalis var. myxogenes) на питательной среде, поддерживая его в трофофазе; на второй ступени культуру переносят в другой биореактор, где нет питательной среды, но имеется глюкоза, из которой синтезируется курдлан. Многоступенчатые процессы присущи генетической инженерии и рДНК-биотехнологии.

К п. 5 «Классификация биотехнологических процессов по стадиям реализации технологии производства»

Рис. Примерная обобщенная схема процессов в биотехнологии

К п. 6 "Классификация биотехнологических процессов по целевым продуктам" и к п. 7 «Классификация биотехнологических процессов по механизму образования конечного продукта»

Характеристика процесса	Целевые продукты	Названия целевых продуктов или процессов
Биосинтез	Метаболиты: преметаболиты	Аминокислоты
		Нуклеозиды
		Нуклеотиды
	первичные	Нуклеиновые кислоты
		Ферменты
	вторичные	Алкалоиды
		Антибиотики
		Гиббереллины
		Гликаны и гликоконьюгаты Органические кислоты, кетоны, спирты
		Липиды
		Аминокислоты, пептидные гормоны
	Клеточная масса	Пекарские и пивные дрожжи
		Кормовой и пищевой белок
		Вакцины и антигенные вещества
Трансформация	Неорганические вещества	Обнаружение металлов
		Обогащение металлов
	Преимущественно органические вещества	Компостирование отходов, получение биогаза
		Детоксикация, дезодорация и обезвреживание, например. ПАВ (поверхностно-активных веществ)
		Определение (анализ) веществ по продуктам трансформации
		Кисломолочные продукты и сыры
		Хлебно-булочные изделия
		Квашение и соление овощей
		Силосование кормов
		Мочка льна и джута
		Ферментация чая, табака, кофе, какао, маслин
		Пивоварение, виноделие винокурение

При биосинтезе имеет место конструктивное или адаптивное образование метаболитов, относящихся к числу преметаболитов, первичных или вторичных метаболитов. В процессах биотрансформации имеет место видоизменение какой-либо молекулы - предшественника конечного продукта или превращение одного продукта в другой.

К п. 8 "Классификация биотехнологических процессов по управлению процессом"

Подразделение биотехнологических процессов на управляемые и неуправляемые опирается на глубину и масштабность контроля, осуществляемого с применением средств автоматики и ЭВМ. К числу неуправляемых процессов можно отнести спонтанно протекающие компостирование плотных отходов в животноводческих комплексах и фермах. К управляемым относятся все производственные процессы, основанные на использовании микробных, растительных и животных клеток. При этом уровень управления может быть двояким - операторским и автоматическим. В первом случае поддержание заданных режимов осуществляет оператор, во втором - соответствующие контрольно-измерительные приборы, автоматы, ЭВМ.

Статья составлена по материалам книги по биотехнологии

Енвд